蛋白纯化采用的方法

　　昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一个昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得表达。。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子。[1]
　　杆状病毒系统的主要有点包括
　　1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配
　　2，蛋白翻译后的加工修饰；
　　3，表达水平高，可达总蛋白量的50%；
　　4，可容纳大分子的插入片段；
　　5，能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时由于病毒，细胞开始死亡。
　　蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
　　微滴式PCRhttp://www.bi***/zh-cn/life-science-research/news/%E5%BE%AE%E6%BB%B4%E5%BC%8F%E6%95%B0%E5%AD%97pcr%E6%AD%A3%E5%BC%8F%E7%99%BB%E9%99%86%E4%B8%AD%E5%9B%BD
　　数字PCRhttp://www.bi***/zh-cn/life-science-research/news/%E5%BE%AE%E6%BB%B4%E5%BC%8F%E6%95%B0%E5%AD%97pcr%E6%AD%A3%E5%BC%8F%E7%99%BB%E9%99%86%E4%B8%AD%E5%9B%BD
　　色谱http://www.bi***/zh-cn/product/chromatographic-surfaces
　　蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。